Coupe et coloration de racines

[Eddy]

Bonjour le forum,

Je sollicite votre avis critique à propos de l'utilisation d'une technique de coupe/coloration de racines (ce sont des Arabidopsis thaliana). Voici le contexte : au labo, nous avons obtenu des lignées d'Arabidopsis transgéniques qui présentent entre autres un phénotype racinaire assez particulier (promis, dès que ce sera publié, vous saurez tout). Je souhaite réaliser des coupes de ces racines pour mettre en évidence une éventuelle altération de la morphologie racinaire (par exemple au niveau de la disposition des vaisseaux conducteurs et/ou de leur nombre). J'ai deux méthodes envisageables :

• Inclusion dans l'agarose 4%, découpe au vibratome (épaisseur ~ 60 µm) et coloration des tissus au vert d'iode/rouge congo.
• Inclusion dans la technovite, découpe au microtome (épaisseur ~ 10 µm) et coloration.

Vu que c'est surtout du screening qui m'intéresse pour le moment, que nous allons publier d'ici un mois et que l'altération de la morphologie n'est pas notre hypothèse la plus forte, la première méthode me semble appropriée car très rapide (déjà proposé à des étudiants en TP, une petite heure en tout). Elle me permettra d'avoir une idée grossière des éventuelles perturbations. Si j'observe quelque chose d'intéressant, je pourrais ensuite me tourner vers la technovite et faire quelque chose de soigné pour la publi (évidemment, le responsable de la plateforme de microscopie me conseille la technovite).

Qu'en pensez-vous ? Pour les coupes et colorations, avez-vous une astuce ? J'ai vu comme tous les superbes clichés au vert Etzold, mais nous n'en avons pas. Les coupes au Ranvier ? Si oui ça ira bien au vibratome aussi. Un grand merci à tous pour votre aide.

Cordialement,
Eddy

[Bernard]

Bonjour.
Si c'est seulement pour un screening des modifications morphologiques générales sans aspect phytochimique on peut se contenter d'une coupe à main levée à la lame de rasoir (en général les racines se coupent bien). Je ne connais pas celle de A. thaliana, elles doivent être petites.
Pour les couper plus facilement (celles qui sont trop molles) on les met une nuit à tremper dans l'alcool à 75%, cela durcit les tissus.
Dans un premier temps on peut faire une observation sans coloration au fond noir (on voit très bien la morphologie générale).
Si la préparation est trop chargée on peut nettoyer les coupes avant à l'eau de javel du commerce diluée deux fois, trempage dix minutes et deux lavages de cinq minutes.
Je n'ai jamais rien vu de mieux pour l'anatomie végétale que le vert de Etzold vendu par Klaus (rapidité + beaux résultats). Dailleurs il faut que je lui en recommande car le mien s'épuise.
Amitiés. Bernard.

[Maraussan]

Bonjour Eddy,
je pense que les réponses "ultimes" pourront être données par Armin Eisner, que tu peux contacter sous le site
http://www.aeisner.de/index.html
C'est un des très grands spécialistes actuel des techniques de colorations et autres...

[Eddy]

Bonsoir Bernard, Alain, le forum,

D'abord, un grand merci à tous les deux pour vos réponses fort instructives. Je vous tiens au courant de mes essais de coupes/colorations. Voici également un premier aperçu des fameuses boucles. On vérifie actuellement s'il s'agit bien d'une altération de la perception du support (thigmotropisme). Brièvement, ces plantes surexpriment un gène de Phytophthora parasitica qui les rend plus sensibles à certains agents pathogènes. La voie de signalisation touchée serait celle de l'éthylène (vérification en cours). Le lien entre l'éthylène et l'auxine est assez bien documenté... et l'auxine est impliquée dans le gravitropisme et le thigmotropisme.

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Je précise que ces boucles sont obtenues sur des boîtes de culture in vitro en position verticale (sur des boîtes à l'horizontale, on en observe chez les plantes sauvages, c'est alors un artefact). Les coupes serviront notamment à voir si les racines ne subissent pas de torsions anormales à cause de ces boucles. Je vous parlerai de tout ça quand l'article sera accepté. Ça me permettra de continuer mes articles sur la biologie moléculaire à partir d'un cas concret de phytopathologie.

Encore merci à vous deux.

Cordialement,
Eddy