Nicotiana tabacum, fluorescence GFP

[Eddy]

Bonsoir le forum,

Je voudrais vous présenter en avant-première quelques clichés réalisés au labo pour préciser la localisation intracellulaire des molécules sur lesquelles je travaille (renommées ici TOTO, TITI et TATA, mais vous vous doutez qu'il ne s'agit pas de leur vrai nom). Les photos montrent des cellules de parenchyme de tabac (Nicotiana tabacum) vues par la face inférieure (abaxiale).

Ces cellules ont été transformées par Agrobacterium tumefaciens selon la méthode d'agrotransformation (je détaille par la suite si ça intéresse des membres du forum). Après deux jours, les zones transformées sont prélevées, montées entre lame et lamelle puis la fluorescence GFP est observée au microscope confocal. D'où vient la fluorescence ? Nous avons fusionné nos molécules TOTO, TITI et TATA à une GFP pour obtenir TOTO-GFP ou GFP-TOTO, TITI-GFP ou GFP-TITI, et TATA-GFP ou GFP-TATA. Ainsi nous pouvons suivre leur localisation (avec quelques réserves).

photos-confocal.jpg (75.82 Kio) Vu 4128 fois

Ces clichés suggèrent que les molécules sont situées dans le cytoplasme et dans le noyau (sauf TATA-1 qui semble liée au réticulum). J'attends d'autres manips pour confirmer. Puis quand ceci et tout ce qui va avec sera bouclé, vous aurez aussi droit à une version "preprint" de l'article en avant-première... avec les vrais noms cette fois-ci. Je n'ai pas trop détaillé pour ne pas écrire un pavé et décourager les lecteurs, mais si vous voulez je peux détailler tous les points évoqués dans ce message.

Cordialement,
Eddy

[BelialL]

mais si vous voulez je peux détailler tous les points évoqués dans ce message.

Surtout n'hésites pas ! Même si il est fort possible que je n'en comprenne que la moitié !

En tout cas, merci de nous faire partager tes travaux !

[Nhan]

Super intéressant! Des détails, des détails

[André]

Bonjour à tous, Eddy

Bien entendu que nous sommes intéressés par les détails de ces travaux.
Ce qui m'interesse particulièrement, c'est interaction Agrobacterium/plante dont tu avais d'ailleurs déjà parlé lors de l'exposé sur tes travaux sur Arabidopsis.
On parle beaucoup de la pollution du pollen OGM sur les cultures voisines mais rarement (voir jamais?) de l'interaction des agrobacterium et la transmission par ce biais du matériel génétique.

[Eddy]

Bonjour Kévin, Nhan, André, le forum,

Merci pour vos messages. Je vais donc préparer une petite présentation des Agrobacterium et de leur utilisation au laboratoire, avec des schémas. Je pense que ça fera un article sur le portail plus qu'une simple réponse ici, car on sort un peu de la simple observation.

Cordialement,
Eddy

[Bernard]

Bonjour.
Je suis preneur pour des sujets intéressants comme celui-ci.
La fluorescence est vraiment un outil remarquable en microscopie (à condition de pouvoir éliminer l'autofluorescence dans certains tissus, le xylème par exemple).
J'ai autrefois pratiqué la technique des anticorps monoclonaux couplés à des composés fluorescents pour suivre les interactions entre bactérie phytopathogène et tissus de l'hôte.
J'étais ensuite passé au couplage de l'anticorps avec des particules d'or suivi de l'obersvation au MET (on a une bien plus grande précision).
Envisages-tu cette prolongation dans tes recherches.
Amitiés. Bernard.

[Eddy]

Bonjour Bernard, le forum,

Pour le MET, je ne pense pas. En revanche je suis effectivement décidé à compléter ces observations par de l'immunodétection. En effet, les clichés actuels sont fragiles. Je pense notamment au risque de clivage de la GFP dans les protéines fusionnées : si le clivage a lieu, il y a séparation de la protéine d'intérêt et de la GFP, de sorte que ce que l'on voit n'est pas sa localisation mais celle de la GFP seule... et ça m'intéresse tout de suite beaucoup moins.

Mais ce n'est pas tout. Je vais aussi partir à la recherche d'interactions protéines-protéines, donc là encore j'ai besoin d'anticorps dirigés contre TOTO, TITI et TATA. Je prépare donc la production des protéines par E. coli... et ensuite on produira des anticorps (un sérum polyclonal dans un premier temps).

Cordialement,
Eddy

[Fredlab]

Intéressant tout ça... la recherche prend un aspect "concret" (mais il est vrai qu'il faut sans doute un certain niveau en sciences du vivants pour que ça soit compréhensible)
Merci pour le partage.