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Biologie structurale et spectroscopie RMN PDF Imprimer Envoyer
Écrit par BelialL   
Dimanche, 09 Juin 2013 14:23

Biologie structurale et spectroscopie RMN

 

 

Spin nucléaire et magnétisation

 

Certains noyaux sont sensibles aux effets d'un champ magnétique.

Ceux-là possèdent un spin différent de 0 et les plus utilisés en biologie sont 1H, 15N et 13C.

 

Le spin est une propriété intrinsèque des particules, il s'agit d'une notion quantique qui n'a pas d'équivalent en mécanique classique. Ce qui nous intéresse, c'est que celui-ci possède un moment cinétique et un moment magnétique.

Le rapport du moment magnétique sur le moment cinétique nous donne le rapport gyromagnétique de l'atome noté γ. Ce rapport gyromagnétique nous permet d'obtenir la fréquence de Larmor de l'atome par la formule f = γ/2π x B où B est le vecteur champ magnétique.

 

550px-Precession_Larmor_2

La fréquence de Larmor est très particulière, il s'agit de la fréquence à laquelle va tourner le noyau lorsque celui-ci sera soumit à un champ magnétique.

Ainsi, lorsque l'on soumet un échantillon à un champ magnétique B0, tous les noyaux possédant des propriétés magnétiques vont tourner à leur fréquence de Larmor autour de la direction du champ magnétique. On dit qu'ils entrent en précession de Larmor.

 

Du fait de l'agitation thermique, tous les moments magnétiques des noyaux ne sont pas orientés dans la direction du champ mais sont orientés plutôt aléatoirement.

Cependant, du fait du champ B0 (orienté en z), il y a un peu plus de noyaux dont la composante z du vecteur moment magnétique est dans le même sens que le champ et donc la magnétisation globale de l'échantillon –donnée par ∑ μi - est dans le même sens que B0.

 

Afin d'obtenir de beaux signaux, on utilise des champs  forts, de l'ordre de 14 Tesla à l'Institut de biologie structurale.

Afin d'obtenir un spectre interprétable, il faut dévier la magnétisation de 90° puis laisser chaque noyau revenir à son état d'équilibre à une vitesse qui lui est propre.

Pour cela, on utilise un deuxième champ magnétique B1, qui va tourner à la même vitesse angulaire que les noyaux qui est donnée par 2πf=ω.

 

660px-Impulsion_RMN

Comme ce champ magnétique tourne en même temps que les noyaux, il s'ajoute à la précession de Larmor et dévie la magnétisation M de 90°, dans le plan (x,y), on peut utiliser des champs faibles ici, de l'ordre de 0.5 mTesla.



Relaxation et décroissance d'induction libre (FID)

 

Après avoir dévié la magnétisation dans le plan à l'aide de l'impulsion magnétique induite par le champ B1, celui-ci est stoppé et les noyaux vont progressivement retourner à leur état d'équilibre.

 

Il s'agit du phénomène de relaxation, on en distingue 2, la relaxation longitudinale dans l'axe z et la relaxation transversale dans le plan. C'est un phénomène extrêmement complexe à modéliser pour un noyau donné, avec des hamiltoniens dépendant du temps et cela fait que la fréquence de résonance ne peut être obtenu que par l'expérience.


RMN_champs_magnetique

La relaxation transversale est enregistré par le spectroscope et si le détecteur est placé en y, alors la rotation de M va produire un signal sous forme de sinusoïde décroissante. Si une seule sinusoïde était présente, alors le signal serait directement interprétable, cependant, on obtient en pratique une superposition de tout les signaux des noyaux qui ont été excité par le champ magnétique, ceci est la FID.

Afin de clarifier les choses, on utilise la transformée de Fourier qui va permettre de transformer le signal f(t) qui est exprimé en fonction du temps en signal F(ν) qui est exprimé en fonction de la fréquence.

 

Ainsi, toutes les sinusoïdes qui dépendent du temps et qui ont une période propre se retrouvent séparées en pics sur un spectre dont l'axe horizontal correspond aux fréquences de résonances, exprimées en ppm par rapport à la référence.

 

FT_trans

 

Ainsi, le spectre devient interprétable puisque toutes les différentes fréquences auxquelles les noyaux tournent pendant la relaxation sont représentée par un simple pic.



Le déplacement chimique

 

Si tous les noyaux tournait à la même fréquence, alors on ne pourrait rien tirer de la spectroscopie RMN, cependant, cela n'est pas le cas heureusement.

 

Chaque noyau possède un environnement qui lui est propre, le (N-) H d'une tyrosine n'aura pas le même environnement dans une protéine que le (N-) H de l'acide aminé suivant.

Autrement, le champ magnétique local ressentit par un noyau lui est propre et dépend de son environnement.

Les électrons jouent un rôle majeur dans ce phénomène, leur mouvement entraîne la création d'un petit champ magnétique autour du noyau, qui a tendance à s'opposer au champ B0. Ce phénomène est appelé le blindage. Plus un noyau est blindé et plus faible sera sa fréquence de résonance. La densité électronique autour d'un noyau quelconque dépend de sa position dans la protéine, de ses voisins, de sa nature.

 

Par exemple, un –CH3 sera fortement blindé car le carbone n'a pas de tendance à amené les électrons vers lui et ceux-ci restent donc autour des H qui ressentent alors un champ Beff = γB0(1-σ) où σ est la constante de blindage qui traduit l'intensité avec laquelle les électrons s'opposent au champ magnétique B0.

 

Ces variations restent cependant très faibles et sont quantifiées en ppm (parties par million).

Afin de pouvoir faire des mesures fiables et d'obtenir des valeurs de référence, on utilise généralement une molécule fortement blindé pour servir de 0 de référence.

Ainsi, les déplacements chimiques sont donnés par rapport à cette molécule.

 

On a la formule : δ = (fobs-fréf)/fréf * 106.



La RMN 2D

 

En pratique, un simple spectre sur une dimension n'est pas interprétable en biologie.

C'est pourquoi on cherche souvent à multiplier les dimensions en enregistrant le spectre de plusieurs types de noyaux à la fois.

 

Une expérience très utilisée en RMN 2D est la [H,N] HSQC (Heteronuclear Single Quantum Correlation).

Le principe est relativement simple. On envoie une série d'impulsion sur les H avec différents angles de sortent que les moments magnétiques des protons agissent sur les N et conduisent donc à transférer la magnétisation sur les N.

On arrêt ensuite l'impulsion pendant un temps t1.

Puis on envoie de nouveau des impulsions afin que la magnétisation des N soit transférée de nouveau aux H.

Enfin, on enregistre le spectre des protons.

 

L'expérience est réalisée plusieurs fois en modulant le temps t1.

Les N perdant en intensité pendant t1 en revenant à leur état d'équilibre, l'amplitude du signal mesuré pour les protons à la fin sera d'autant plus petite que t1 sera grand puisque les N auront perdus en intensité avec de re-transférer leur magnétisation aux H.

Ainsi, on obtient la temps de retour à l'équilibre des noyaux N pour le temps t1 auquel les protons ne résonne plus du tout au deuxième transfert et comme la FID décroît selon la formule exp(-t1/T2) où T2 est la période de l'oscillation, on peut retrouver la fréquence de résonance associé au noyau N.

Les points formant la FID sont enregistrés dans une matrice, il suffit alors de faire une double transformée de Fourier pour les lignes et les colonnes afin d'obtenir sur un axe les fréquences des H et sur l'autre les fréquences des N.

On obtient alors ce genre de spectre :

 

24689_49

Chaque point représente un pic vu de dessus, comme en HSQC, le transfert de magnétisation se fait à travers la liaison chimique, on a alors un pic pour un acide aminé.

Ainsi, si la protéine a 100 acides aminés sans proline, alors on aura 100 pics correspondant aux N-H de la liaison peptidique.

Il ne reste plus qu'à attribué chaque pic à chaque acide aminé. Pour cela, on va souvent plus loin avec des expériences plus complexes et de la RMN 3D.

Si ensuite, on ajoute une autre protéine qui interagit avec la première, on peut alors savoir sur quels acides aminés porte l'interaction et s'il y a des conséquences pour la structure.

Les différentes expériences de RMN permettent de voir beaucoup de choses, la séquence de la protéine, sa structure, sa conformation dans l'espace, sa dynamique, son interaction avec d'autres protéines à une résolution atomique…

 

En bref, le développement de cette technologie à été une petite révolution pour la recherche scientifique en général et ça continu encore !

 

 

Cela s'éloigne un peu des activités naturalistes mais cette technique peut être très efficace pour mieux comprendre les systèmes écologiques et les relations entre les différentes espèces.

Pour l'instant, les crédits vont surtout pour la recherche en bactério, oncologie et immunologie mais on pourrait bien voir arriver un jour des expériences RMN pour des sujets d'écologie et de caractéristion d'espèces.

Mise à jour le Dimanche, 09 Juin 2013 16:55