Le Naturaliste

Bonjour a tous,

Un des membres a t-il une expérience des inclusion de tissus végétaux ( tiges racines feuilles étamines etc...) en paraffine avant coupe au microtome type Minot ? Même procédure que pour les tissus animaux.

Quelle est la procédure , notamment les temps de déshydratation et d'éclaircissement , temps d'immersion dans la paraffine.

Les photos de coupes dans l'ouvrage d Anna SPERANZA et Gian Lorenzo CALZONI " Atlas de la structure des plantes " font penser à cette technique en raison de la finesse des coupes par comparaison à ce que l'on obtient avec un microtome à main type Ranvier.

Existe -t-il des milieux d'inclusion en milieu aqueux .

Merci de vos conseils et de vos expériences techniques si quelqu'un est intéressé par le sujet .

Un des membres a t-il une expérience des inclusion de tissus végétaux (tiges racines feuilles étamines etc...) en paraffine avant coupe au microtome type Minot ? Même procédure que pour les tissus animaux.

Oui !
Oublie tout, cela ne marche pas ...

En 2008 (histoire de ne pas parler de techniques balbutiantes utilisées dans les années 70), il faut refaire un point vers les PEG...
Un topo serait en préparation, par JeanMarie, je crois ?

Bonjour Katzen,

Existe -t-il des milieux d'inclusion en milieu aqueux .

Le PEG !
(voir sur le forum, sujets de Ralf (ralfwagner) et de klaus)

*message croisé avec Maraussan

Bonjour à tous,Gérard

je scande avec les collègues: PEG!!!

j'ai découvert ce produit très récemment (Ralph m'y a initié) et cela a été une révélation pour moi!
La coupe des apothécies de Massalongia (700µm de diamètre ) a été faite grâce à une inclusion dans le PEG 1500

Bonsoir à tous,
la pénétration de la résine aqueuse PEG se fait-elle convenablement en profondeur des tissus (tous les types de tissus végétaux), ou bien celle-ci est limitée et oblige donc à manipuler de très petits volumes d'échantillons ??

Bonsoir à tous,

Pour ceux qui voudraient en savoir plus sur les coupes au Polyéthylène glycol (PEG), j'ai trouvé cette fiche très intéressante de Marcel Lecomte sur son site "Champignons passion" :
http://users.skynet.be/Champignons_pass ... pesPEG.htm

J'ai vu aussi, sur Wikipédia je crois, que le PEG est utilisé en pharmacie par exemple pour des suppositoires. Il devrait donc être possible de s'en procurer autrement qu'en flacons minuscules... (Lesquels ont le don de m'énerver !)

L'inclusion à la paraffine reste toujours la methode de choix pour l'histologie animale mais aussi pour les tissus végétaux.
Les echantillons peu lignifiee sont coupez avec un microtome rotative, les objects lignifiee avec un microtome a glissière comme le Reichert-Jung Hn-40, mais les objects tres dur sont coupez avec des microtomes a glissieres tres lourd et solide comme le Leitz 1300, le Jung Tetrander ou le Jung Model K.
Ces microtomes ce vend de temps en temps sur Ebay a des prix plus ou moin modeste (L.1300: € 400 env., Petit Tetrander: €200 env. Pour le Model K on doit payer plus: € 800 - € 1000).

Si c'est neccesaire on peut congeler les blocs de parafine à -30°C avant/pendent qu'on fait des coupes. Pour cela moi j'utilise un vieux Leitz/Lauda Kryomat TKL-E.

Pour avoir un idee de ce genre de machinerie voir quelques pris de vue: http://tinyurl.com/buyorf et http://tinyurl.com/angxvs .

Quand on a qu'un microtome rotative et les echantillions sont tres lignifiee on peut faire l'inclusion à la paraffine en utilisant un autre alcool que l'alcool ethylique 90%-95% qui peut rendre les pieces extremement dur. Pour ce genre des echantillons on utilise le 2-etoxy-ethanol ("cellosolve") ou un des alcools butilique.


Protocol en general: inclusion à la paraffine, en utilisant l'alcool isopropylique comme dissolvant de la paraffine. Rien n'est plus facile.

- Des pieces de tissue, ne depassant pas 3-4mm sur leurs plus petite cote, fixez, lavez et dans l'eau

- alcool ethylique 50%: 4h
- alcool ethylique 70%: 4h
- alcool ethylique 90% - 95%: 4h
- alcool ethylique 90% - 95%: 4h
- alcool isopropylique absolu: 4h
- alcool isopropylique absolu: 4h
- alcool isopropylique absolu. Place le flacon bien ferme dans un etuve mis a la point de fusion de la paraffine. Ajouter de temps en temps des petites pieces de paraffine dans l'alcool isopropylique pour obtenir finalement une melange d'environ 1/1 d'alcool isopropylique/paraffine. Melanger de temps en temps: 4h
- Paraffine: 4h
- Paraffine: 4h
- Dernier bain de paraffine: 4h

Fait les blocs.

Les echantillons non ou peu lignifiee sont coupes avec un couteau B ou C ou en utilisant des lames jetables de 35°. N'utilise/n'achete pas les lames de 22°, celui-la sont pour la cryotomie seulement. Les blocs dur sont coupes avec un couteau D, preferablement un couteau Widia.
Les couteaux pour la microtomie se vend sur Ebay. Quelques marques moin connu, alors moin chere sont Dosch et Slee. Des couteaux nouveaux B et C pour la microtomie a des prix plus ou moin modeste: Euromex.

Moi je trouve l'inclusion à la paraffine beaucoup plus simple que l'impregnation avec le PEG et les blocs de paraffine gardent pour des annees, ce qui n'est pas les cas avec les blocs de PEG.

Bonjour Yvan,

Je te remercie beaucoup de ta réponse très documentée sur les inclusions en paraffine des tissus végétaux.La réponse de Maraussan m'avait laissée très déconcerté. Je fais des essais depuis plusieurs mois sur les végétaux et l'on obtient des coupes très fine et très précises mais j'ai beaucoup de rétractions - et des tissus assez cassants et morcelés à la coupe. Est ce a cause de la déshydratation trop poussée de la cellulose par l'alcool éthylique , comment eviter ce durcissement ? je ne savait pas que l'alcool isopropylique était miscible avec la paraffine et là tu m'ouvre des horizons nouveaux.

Je pense que nous reparlerons de ce sujet et de mes tentatives !

Encore merci de tes lumières.

Amicalement
Katzen

Ps une petite coupe a 12 µ colorée a l'Etzold Vert de Klaus.

Bonjour,

Je possède comme Katzen "L'Atlas de la structure des plantes" de A.Speranza & G.L Calzoni, et admiratif des coupes et photos produites...Ainsi que celles faites par certains de nos intervenants.

Concernant les microtomes, je possède un Ranvier avec lequel je n'arrive pas à faire des coupes suffisament fines, et un Minot remisé que je pense remettre en service.
Je voulais savoir néanmoins si l'on pouvait faire les coupes du matériel botanique inclus dans du PEG, avec ce type de microtome (il fonctionne particulièrement bien avec les inclusions dans la paraffine).

J'ai pensé acquérir le microtome modèle "Cambridge"(Rocking microtome), mais je n'ai jamais lu aucun retour sur son utilisation

Par ailleurs, je viens également d'apprendre que l'on pouvait substituer l'Alcool isopropylique au toluène ou au xylène comme solvant de la paraffine ce qui est un plus pour continuer à utiliser cette substance d'inclusion.(Stockage indéfini et facilité d'en trouver dans le commerce):

Protocol en general: inclusion à la paraffine, en utilisant l'alcool isopropylique comme dissolvant de la paraffine. Rien n'est plus facile.

Le déparaffinage sans toluène ne serait donc plus un problème, d'après Yvan
Car le problème connexe est de se procurer certains de ces produits pour un particulier(Ex: le toluène)
Alors comme milieu d'inclusion : PEG ou paraffine
Et merci pour toutes ses informations
A+
Alain

Bonjour Flideck56 - et Yvan , à tous .

La société Carl ROTH commercialise un produit d'éclaircissement en substitution du xylol ou toluène tous toxiques , par du "Roticlear" : ref :

http://www.fr.carlroth.com/catalogue/ca ... r&catId=FR

J'ai fait quelques essais avec du PEG 4000 et 20000 - sans résultat probant, les prélèvements frais se ratatinent en quelques secondes dans le PEG chaud et lors des coupes le tissus n'est pas inclus ni bien pénétré par le PEG ? Il reste mou et impropre a la coupe. De plus le PEG durcit s'effrite et ne permet pas des coupes régulières avec le microtome type Minot . Je pense que le protocole n'est pas bon.
Je vais persévérer avec la paraffine et surtout affiner les phases de déshydratation avec de l' alcool isopropylique.

Merci encore de vos avis critiques.

@+

Katzen

Une coupe de tige de nénuphar avec sclérite ( 12 µ inclusion paraffine )