Caryotype : séparation et coloration des chromosomes humains
Posté : 01 nov. 2007 19:18
Suite à ce sujet http://www.lenaturaliste.net/forum/view ... =141&t=259, et histoire de faire avancer les connaissances de chacun, j'ai ressorti de mes archives mon rapport de stage de DUT de Biologie datant de 1992. J'ai même retrouvé la disquette et vous livre donc ici le protocole de la technique du caryotype en bandes R chez l'homme (je faisais cela avec un microscope Leitz Diaplan et un labo photo complet en chambre noire, malheureusement, les lames que j'avais gardées sont détruites car elles n'étaient pas fixées sous lamelles) :
II1 QU'EST CE QUE LA CYTOGENETIQUE ?
On l'appelle aussi la cytologie génétique. C'est l'étude des chromosomes qui constituent le matériel génétique et héréditaire d'une cellule.
Cette étude aboutit à l'établissement d'une carte d'identité génétique.
Le caryotype est le classement des 46 chromosomes humains selon des critères précis de taille, de morphologie et de nombre.
On distingue :
- 22 paires d'autosomes,
- 1 paire de gonosomes (chromosomes sexuels)
L'interprétation du caryotype consiste à préciser le nombre et l'aspect normal ou non des chromosomes.
Le cas échéant, les anomalies chromosomiques sont décrites selon la nomenclature internationale.
II2 HISTORIQUE
Bien que le caryotype de la drosophile soit connu depuis le premier quart du siècle, le caryotype humain fut seulement décrit en 1956 par TIJO et LEVAN.
En 1959, LEJEUNE, GAUTIER et TURPIN découvre la trisomie 21.
En 1963, DE GROUCHY découvre une anomalie de structure des chromosomes, la maladie du cri du chat.
Mais ces découvertes sont faites avec des techniques rudimentaires et donnent des résultats aléatoires.
Il n'y avait pas encore de colorations en bande mais au GIEMSA dans la masse.
Le caryotype n'était pas un examen de routine.
Pendant les années 70, de nouvelles techniques ont été mises au point permettant le formidable développement de la cytogénétique que l'on connaît:
- 70 : DE GROUCHY met au point la culture des fibroblastes.
Mise au point du blocage de la mitose en métaphase par la colchicine.
CASPERSSON crée le marquage en bandes Q (surtout utilisé pour l'étude du chromosome Y).
- 71 : HAMERTON met au point la culture de lymphocytes.
ARRIGHI crée le marquage en bandes C (marquage de l'hétérochromatine centromérique).
DUTRILLAUX crée le marquage en bandes G (dénaturation enzymatique par la trypsine).
DUTRILLAUX et LEJEUNE créent le marquage en bandes R (dénaturation thermique ménagée).
- 73 : DUTRILLAUX crée le marquage en bandes T (marquage des télomères, variante du marquage en bandes R).
- 76 : YUNIS met au point une technique de marquage haute résolution (par déspiralisation des chromosomes) qui porte son nom.
Les années 80 voient l'avènement de techniques très fines :
- microcytogénétique : caryotype de très haute résolution (3000kb).
- biologie moléculaire : repérage de séquences de 50kb.
- cytogénétique moléculaire : hybridation in situ (HIS) qui permet de repérer des gènes clonés in situ. Il existe deux techniques :
- avec sondes froides,
- avec sondes chaudes (isotopes), la résolution descend jusqu'à 20kb.
II3 A QUI PRESCRIT-ON UN CARYOTYPE ?
On peut définir différentes sortes de consultants :
- des parents dont l'enfant à une anomalie congénitale.
- des couples qui ont eu des antécédents : fausses couches spontanées (échecs de reproduction) ou anomalie congénitale d'un parent.
- des couples inquiets qui souhaitent écarter tous risques d'anomalies congénitales et qui demandent un conseil génétique.
Ces études sont aussi effectuées sur les enfants encéphalopathes de l'hôpital.
Les rencontres avec les couples de consultants ont un caractère troublant et désorientant au début. L'adaptation doit se faire progressivement en tenant compte du côté perturbant de la situation que vivent les consultants.
II4 CARYOTYPE EN BANDES R
La technique d'établissement d'un caryotype se base sur la capacité de division de cellules mises en culture. Chaque laboratoire emploie sa propre technique et il n'existe de ce fait pas de recette standard. L'établissement d'une carte d'identité génétique demande 17 heures de technique.
La technique peut être faîte à partir de différents prélèvements :
- sang circulant,
- moelle osseuse,
- liquide amniotique,
- grattage de peau.
La technique se décompose principalement en huit phases :
- le prélèvement des cellules,
- la culture des cellules,
- le blocage des mitoses en métaphase,
- le choc hypotonique,
- les fixations,
- l'étalement,
- la dénaturation,
- la coloration.
Remarque :
Tous les tubes et lames utilisés sont soigneusement identifiés pour éviter toute erreur.
II41 Le prélèvement des cellules
La technique est réalisée sur les lymphocytes du sang circulant. On prélève donc 10ml de sang sur tube hépariné dans les conditions habituelles de prélèvement (unité de prélèvement VACUTAINER).
II42 La culture des cellules
Cette étape de la technique demande, comme la précédente, des conditions de stérilité parfaites.
Elle est faites sous une hotte à flux laminaire uniquement réservée à la cytogénétique. Les manipulations se font dessus un bec Bunsen.
Le technicien utilise des gants et des pipettes stériles à usage unique.
Cette étape se déroule comme suit :
- préparation du milieu 199 dilué et complémenté,
- préparation du milieu de culture,
- ensemencement de ce dernier,
- incubation.
Préparation du milieu 199 dilué et complémenté
Le milieu de base 199 de formule très complexe (Annexe 5) doit être dilué dans de l'eau distillée stérile et complémenté en glutamine (cet acide aminé n'est pas stable au cours du temps). On y ajoute une solution de bicarbonate de sodium pour tamponner le milieu et de la péni-strepto, mélange de pénicilline et de streptomycine, pour limiter le risque de contamination du milieu.
Pour le détail des quantités, voir l'annexe 6.
préparation du milieu de culture
Celle-ci se fait directement dans les tubes coniques CORNING qui seront incubés et centrifugés plus tard.
Le milieu de culture est un mélange de :
- milieu 199 dilué et complémenté.
- Phyto C : phytohémagglutinine C, agent mitotique,qui va augmenter la multiplication et la croissance des lymphocytes.
- Liquémine : héparine renforçant l'effet anticoagulant déjà prévu lors du prélèvement.
- Ultroser Hy : milieu de substitution du sérum. Il contient des hormones, des facteurs de croissance et d'autres constituants favorisants la culture. Sa composition est tenue secrète par le fabricant, mais l'utilisation d'un tel produit permet de garantir une composition constante.
Pour le détail des quantités, voir l'annexe 6.
On ensemence deux tubes avec Ultroser Hy et un sans pour chaque patient. Le sang est directement introduit dans les tubes coniques contenant le milieu de culture. Mais les quantités de sang varient suivant l'âge du patient :
- nouveau-né (moins d'un an) 0,45 à 0,50ml,
- enfant (1à 10 ans) 0,50 à 0,55ml,
- adulte (plus de 10 ans) 0,55 à 0,60ml.
Incubation
Les tubes coniques sont fermés et mis à l'étuve (réservée à cet effet) 72 ou 96 heures à 37°C.
II43 Le blocage des mitoses en métaphase
Cette étape ainsi que les suivantes ne sont plus faites dans les conditions de stérilité. Cependant le port de gants est obligatoire afin de garantir une sécurité optimale pour le technicien.
Après incubation, les tubes sont ouverts. On y introduit alors 200µl de colchicine (poison du fuseau mitotique) qui va bloquer les mitoses en métaphase.
Les tubes refermés sont mis une heure trente à l'étuve pour laisser agir la colchicine.
II44 Le choc hypotonique
Le choc hypotonique fait gonfler puis éclater les cellules. Ce qui permettra aux chromosomes de se disperser à l'étalement.
Le milieu est constitué de sérum de veau, de hyaluronidase (enzyme de diffusion), de MgCl2 et d'eau. Pour les quantités, voir l'annexe 7.
Le protocole
- Les tubes coniques sont centrifugés 10 minutes à 1600tr/min,
- le surnageant est aspiré,
- tout en agitant le tube avec un vortex, on ajoute 8ml de milieu par pipette de 2ml, la première étant versée goutte à goutte,
- les tubes sont mis 20 minutes à l'étuve à 37°C.
II45 Les fixations
Les fixations permettent l'élimination de tous les éléments du sang qui ne nous intéressent pas (érythrocytes...) et le lavage des lymphocytes éclatés.
Le fixateur est constitué de 3 volumes d'alcool éthylique pour 1 volume d'acide acétique glacial.
On procède à trois fixations :
Première fixation
- Les tubes sont sortis de l'étuve et ouverts,
- Les tubes sont centrifugés 10 minutes à 1600tr/min,
- le surnageant est aspiré,
- tout en agitant le tube avec un vortex, on ajoute 4 pipettes de 2ml de fixateur, la première étant versée goutte à goutte jusqu'à ce que le liquide devienne marron,
- les tubes sont fermés et laissés 20 minutes à température ambiante.
Deuxième fixation
- les tubes sont centrifugés 10 minutes à 1600tr/min,
- le surnageant est aspiré,
- tout en agitant le tube avec un vortex, on ajoute 2 pipettes de 2ml de fixateur,
- les tubes sont fermés et laissés 10 minutes à température ambiante.
Troisième fixation
- les tubes sont centrifugés 10 minutes à 1600tr/min,
- le surnageant est aspiré,
- tout en agitant le tube avec un vortex, on ajoute 1 pipette de 2ml de fixateur.
Fin des fixations
Les tubes sont immédiatement fermés et centrifugés pendant 10 minutes à 1600tr/min.
II46 L'étalement
La réussite d'un étalement est fonction des facteurs suivants :
- la propreté de la lame,
- la présence de buée sur la lame pendant l'étalement,
- le pourcentage hygrométrique,
- la température de l'air du laboratoire.
Pour obtenir des lames parfaitement propres, on utilise des lames neuves, dégraissées à l'alcool puis séchées à l'aide de compresses.
La présence de buée est due à la conservation des lames au congélateur. L'évaporation de cette buée interdit l'étalement des gouttes de la suspension.
Les deux derniers facteurs varient en fonction de la situation météorologique. C'est pour cela que l'on effectue des essais d'étalement sur un ou deux patients selon trois méthodes :
- sur papier filtre sec,
- sur papier filtre mouillé,
- sur papier filtre sec à proximité d'un bec Bunsen,
pour rétablir des conditions optimales pour l'étalement.
Les essais sont colorés puis observés au microscope à l'objectif x100 à immersion
Un bon étalement est réalisé lorsque les chromosomes sont bien dispersés sur un champ microscopique.
La technique d'étalement est certainement l'étape la plus difficile à réaliser :
Les lames sont sorties une par une du congélateur et placées dans les conditions adéquates (papier sec ou mouillé...).
Deux à trois gouttes de la suspension sont alors projetées sur la lame avant que la buée ait disparu.
On procède en général à dix lames par patient, mais seul deux tubes sont utilisés, le troisième étant conservé dans un réfrigérateur.
Après séchage des étalements à température ambiante, les lames sont placées une semaine dans un réfrigérateur. Cette phase permet de faire "vieillir" les étalements pour permettre une meilleure dénaturation.
II47 La dénaturation
C'est une dénaturation thermique ménagée dans un bain marie à 87,5°C en milieu acide (pH=5,5), le réactif de Herrl.
On procède à un essai sur une lame pour déterminer le meilleur temps de dénaturation (on commence par une durée de 1 heure) :
Si les télomères sont davantages marqués que le reste des chromosomes, il faut diminuer le temps de dénaturation.
Si les chromosomes sont trop uniformément colorés (pas de marquage), il faut augmenter le temps de dénaturation.
A la fin du temps de dénaturation, les lames sont plongées dans l'eau froide pour arrêter la dénaturation.
II48 La coloration
Le colorant doit être préparé extemporanément, il se compose de :
- 2ml de GIEMSA,
- 2ml de tampon phosphate à pH=6,7 ,
- qsp 100ml d'eau distillée.
La coloration dure trois minutes. Les lames sont rincer par passage rapide dans l'eau.
II49 L'observation microscopique
Les lames sont observées au microscopique optique à l'objectif 100. Les mitoses les mieux étalées sont photographiées.
Le nombre de mitose devant être compté et photographié varie suivant la recherche que l'on fait (Trisomie 32, 10 mitoses photographiées, 2 découpées...).
II5 ETUDE DU CARYOTYPE
Les photographies sont agrandies puis les chromosomes sont découpés et classés par paire selon leur morphologie (définie puis précisée en 1960, 1963 et 1966).
II1 QU'EST CE QUE LA CYTOGENETIQUE ?
On l'appelle aussi la cytologie génétique. C'est l'étude des chromosomes qui constituent le matériel génétique et héréditaire d'une cellule.
Cette étude aboutit à l'établissement d'une carte d'identité génétique.
Le caryotype est le classement des 46 chromosomes humains selon des critères précis de taille, de morphologie et de nombre.
On distingue :
- 22 paires d'autosomes,
- 1 paire de gonosomes (chromosomes sexuels)
L'interprétation du caryotype consiste à préciser le nombre et l'aspect normal ou non des chromosomes.
Le cas échéant, les anomalies chromosomiques sont décrites selon la nomenclature internationale.
II2 HISTORIQUE
Bien que le caryotype de la drosophile soit connu depuis le premier quart du siècle, le caryotype humain fut seulement décrit en 1956 par TIJO et LEVAN.
En 1959, LEJEUNE, GAUTIER et TURPIN découvre la trisomie 21.
En 1963, DE GROUCHY découvre une anomalie de structure des chromosomes, la maladie du cri du chat.
Mais ces découvertes sont faites avec des techniques rudimentaires et donnent des résultats aléatoires.
Il n'y avait pas encore de colorations en bande mais au GIEMSA dans la masse.
Le caryotype n'était pas un examen de routine.
Pendant les années 70, de nouvelles techniques ont été mises au point permettant le formidable développement de la cytogénétique que l'on connaît:
- 70 : DE GROUCHY met au point la culture des fibroblastes.
Mise au point du blocage de la mitose en métaphase par la colchicine.
CASPERSSON crée le marquage en bandes Q (surtout utilisé pour l'étude du chromosome Y).
- 71 : HAMERTON met au point la culture de lymphocytes.
ARRIGHI crée le marquage en bandes C (marquage de l'hétérochromatine centromérique).
DUTRILLAUX crée le marquage en bandes G (dénaturation enzymatique par la trypsine).
DUTRILLAUX et LEJEUNE créent le marquage en bandes R (dénaturation thermique ménagée).
- 73 : DUTRILLAUX crée le marquage en bandes T (marquage des télomères, variante du marquage en bandes R).
- 76 : YUNIS met au point une technique de marquage haute résolution (par déspiralisation des chromosomes) qui porte son nom.
Les années 80 voient l'avènement de techniques très fines :
- microcytogénétique : caryotype de très haute résolution (3000kb).
- biologie moléculaire : repérage de séquences de 50kb.
- cytogénétique moléculaire : hybridation in situ (HIS) qui permet de repérer des gènes clonés in situ. Il existe deux techniques :
- avec sondes froides,
- avec sondes chaudes (isotopes), la résolution descend jusqu'à 20kb.
II3 A QUI PRESCRIT-ON UN CARYOTYPE ?
On peut définir différentes sortes de consultants :
- des parents dont l'enfant à une anomalie congénitale.
- des couples qui ont eu des antécédents : fausses couches spontanées (échecs de reproduction) ou anomalie congénitale d'un parent.
- des couples inquiets qui souhaitent écarter tous risques d'anomalies congénitales et qui demandent un conseil génétique.
Ces études sont aussi effectuées sur les enfants encéphalopathes de l'hôpital.
Les rencontres avec les couples de consultants ont un caractère troublant et désorientant au début. L'adaptation doit se faire progressivement en tenant compte du côté perturbant de la situation que vivent les consultants.
II4 CARYOTYPE EN BANDES R
La technique d'établissement d'un caryotype se base sur la capacité de division de cellules mises en culture. Chaque laboratoire emploie sa propre technique et il n'existe de ce fait pas de recette standard. L'établissement d'une carte d'identité génétique demande 17 heures de technique.
La technique peut être faîte à partir de différents prélèvements :
- sang circulant,
- moelle osseuse,
- liquide amniotique,
- grattage de peau.
La technique se décompose principalement en huit phases :
- le prélèvement des cellules,
- la culture des cellules,
- le blocage des mitoses en métaphase,
- le choc hypotonique,
- les fixations,
- l'étalement,
- la dénaturation,
- la coloration.
Remarque :
Tous les tubes et lames utilisés sont soigneusement identifiés pour éviter toute erreur.
II41 Le prélèvement des cellules
La technique est réalisée sur les lymphocytes du sang circulant. On prélève donc 10ml de sang sur tube hépariné dans les conditions habituelles de prélèvement (unité de prélèvement VACUTAINER).
II42 La culture des cellules
Cette étape de la technique demande, comme la précédente, des conditions de stérilité parfaites.
Elle est faites sous une hotte à flux laminaire uniquement réservée à la cytogénétique. Les manipulations se font dessus un bec Bunsen.
Le technicien utilise des gants et des pipettes stériles à usage unique.
Cette étape se déroule comme suit :
- préparation du milieu 199 dilué et complémenté,
- préparation du milieu de culture,
- ensemencement de ce dernier,
- incubation.
Préparation du milieu 199 dilué et complémenté
Le milieu de base 199 de formule très complexe (Annexe 5) doit être dilué dans de l'eau distillée stérile et complémenté en glutamine (cet acide aminé n'est pas stable au cours du temps). On y ajoute une solution de bicarbonate de sodium pour tamponner le milieu et de la péni-strepto, mélange de pénicilline et de streptomycine, pour limiter le risque de contamination du milieu.
Pour le détail des quantités, voir l'annexe 6.
préparation du milieu de culture
Celle-ci se fait directement dans les tubes coniques CORNING qui seront incubés et centrifugés plus tard.
Le milieu de culture est un mélange de :
- milieu 199 dilué et complémenté.
- Phyto C : phytohémagglutinine C, agent mitotique,qui va augmenter la multiplication et la croissance des lymphocytes.
- Liquémine : héparine renforçant l'effet anticoagulant déjà prévu lors du prélèvement.
- Ultroser Hy : milieu de substitution du sérum. Il contient des hormones, des facteurs de croissance et d'autres constituants favorisants la culture. Sa composition est tenue secrète par le fabricant, mais l'utilisation d'un tel produit permet de garantir une composition constante.
Pour le détail des quantités, voir l'annexe 6.
On ensemence deux tubes avec Ultroser Hy et un sans pour chaque patient. Le sang est directement introduit dans les tubes coniques contenant le milieu de culture. Mais les quantités de sang varient suivant l'âge du patient :
- nouveau-né (moins d'un an) 0,45 à 0,50ml,
- enfant (1à 10 ans) 0,50 à 0,55ml,
- adulte (plus de 10 ans) 0,55 à 0,60ml.
Incubation
Les tubes coniques sont fermés et mis à l'étuve (réservée à cet effet) 72 ou 96 heures à 37°C.
II43 Le blocage des mitoses en métaphase
Cette étape ainsi que les suivantes ne sont plus faites dans les conditions de stérilité. Cependant le port de gants est obligatoire afin de garantir une sécurité optimale pour le technicien.
Après incubation, les tubes sont ouverts. On y introduit alors 200µl de colchicine (poison du fuseau mitotique) qui va bloquer les mitoses en métaphase.
Les tubes refermés sont mis une heure trente à l'étuve pour laisser agir la colchicine.
II44 Le choc hypotonique
Le choc hypotonique fait gonfler puis éclater les cellules. Ce qui permettra aux chromosomes de se disperser à l'étalement.
Le milieu est constitué de sérum de veau, de hyaluronidase (enzyme de diffusion), de MgCl2 et d'eau. Pour les quantités, voir l'annexe 7.
Le protocole
- Les tubes coniques sont centrifugés 10 minutes à 1600tr/min,
- le surnageant est aspiré,
- tout en agitant le tube avec un vortex, on ajoute 8ml de milieu par pipette de 2ml, la première étant versée goutte à goutte,
- les tubes sont mis 20 minutes à l'étuve à 37°C.
II45 Les fixations
Les fixations permettent l'élimination de tous les éléments du sang qui ne nous intéressent pas (érythrocytes...) et le lavage des lymphocytes éclatés.
Le fixateur est constitué de 3 volumes d'alcool éthylique pour 1 volume d'acide acétique glacial.
On procède à trois fixations :
Première fixation
- Les tubes sont sortis de l'étuve et ouverts,
- Les tubes sont centrifugés 10 minutes à 1600tr/min,
- le surnageant est aspiré,
- tout en agitant le tube avec un vortex, on ajoute 4 pipettes de 2ml de fixateur, la première étant versée goutte à goutte jusqu'à ce que le liquide devienne marron,
- les tubes sont fermés et laissés 20 minutes à température ambiante.
Deuxième fixation
- les tubes sont centrifugés 10 minutes à 1600tr/min,
- le surnageant est aspiré,
- tout en agitant le tube avec un vortex, on ajoute 2 pipettes de 2ml de fixateur,
- les tubes sont fermés et laissés 10 minutes à température ambiante.
Troisième fixation
- les tubes sont centrifugés 10 minutes à 1600tr/min,
- le surnageant est aspiré,
- tout en agitant le tube avec un vortex, on ajoute 1 pipette de 2ml de fixateur.
Fin des fixations
Les tubes sont immédiatement fermés et centrifugés pendant 10 minutes à 1600tr/min.
II46 L'étalement
La réussite d'un étalement est fonction des facteurs suivants :
- la propreté de la lame,
- la présence de buée sur la lame pendant l'étalement,
- le pourcentage hygrométrique,
- la température de l'air du laboratoire.
Pour obtenir des lames parfaitement propres, on utilise des lames neuves, dégraissées à l'alcool puis séchées à l'aide de compresses.
La présence de buée est due à la conservation des lames au congélateur. L'évaporation de cette buée interdit l'étalement des gouttes de la suspension.
Les deux derniers facteurs varient en fonction de la situation météorologique. C'est pour cela que l'on effectue des essais d'étalement sur un ou deux patients selon trois méthodes :
- sur papier filtre sec,
- sur papier filtre mouillé,
- sur papier filtre sec à proximité d'un bec Bunsen,
pour rétablir des conditions optimales pour l'étalement.
Les essais sont colorés puis observés au microscope à l'objectif x100 à immersion
Un bon étalement est réalisé lorsque les chromosomes sont bien dispersés sur un champ microscopique.
La technique d'étalement est certainement l'étape la plus difficile à réaliser :
Les lames sont sorties une par une du congélateur et placées dans les conditions adéquates (papier sec ou mouillé...).
Deux à trois gouttes de la suspension sont alors projetées sur la lame avant que la buée ait disparu.
On procède en général à dix lames par patient, mais seul deux tubes sont utilisés, le troisième étant conservé dans un réfrigérateur.
Après séchage des étalements à température ambiante, les lames sont placées une semaine dans un réfrigérateur. Cette phase permet de faire "vieillir" les étalements pour permettre une meilleure dénaturation.
II47 La dénaturation
C'est une dénaturation thermique ménagée dans un bain marie à 87,5°C en milieu acide (pH=5,5), le réactif de Herrl.
On procède à un essai sur une lame pour déterminer le meilleur temps de dénaturation (on commence par une durée de 1 heure) :
Si les télomères sont davantages marqués que le reste des chromosomes, il faut diminuer le temps de dénaturation.
Si les chromosomes sont trop uniformément colorés (pas de marquage), il faut augmenter le temps de dénaturation.
A la fin du temps de dénaturation, les lames sont plongées dans l'eau froide pour arrêter la dénaturation.
II48 La coloration
Le colorant doit être préparé extemporanément, il se compose de :
- 2ml de GIEMSA,
- 2ml de tampon phosphate à pH=6,7 ,
- qsp 100ml d'eau distillée.
La coloration dure trois minutes. Les lames sont rincer par passage rapide dans l'eau.
II49 L'observation microscopique
Les lames sont observées au microscopique optique à l'objectif 100. Les mitoses les mieux étalées sont photographiées.
Le nombre de mitose devant être compté et photographié varie suivant la recherche que l'on fait (Trisomie 32, 10 mitoses photographiées, 2 découpées...).
II5 ETUDE DU CARYOTYPE
Les photographies sont agrandies puis les chromosomes sont découpés et classés par paire selon leur morphologie (définie puis précisée en 1960, 1963 et 1966).
mais c juste pour me faciliter la tache,