Montages définitifs

[Olivier]

Bonjour à tous,

Au cas où vous penseriez tester l'aquatex pour les montages de coupes, je vous le déconseille :
- Quasi impossible de faire un montage de coupe sans bulles
- Rétraction du milieu trop importante, l'air finit toujours par rentrer

Pourtant c'est très très pratique mais, ça vaut rien sur le long terme à mon sens. Toutes mes coupes montées à l'aquatex partent à la casse...

Amicalement

[Fredlab]

Hello

Alain, merci encore.
Pour le "conservateur", je vais chercher... on verra bien...

Sinon, pour l'histoire du PEG 4000, je me base sur quelques lectures (puisque je n'ai pas encore essayé) - contradictoires
-> dans un protocole, on dit que le PEG 4000 (voire 2000...) est trop dur, qu'il ne va pas faire de beaux copeaux. Par ailleurs, chez Roth, on ne dépasse pas le PEG 2000 (donc...)
-> sur le protocole de Marcel Lecomte (voir discussion à propos du microtome), il est fait état de PEG 20 000

In fine, le carmino-vert est un peu désuet (très terne en microphotographie), passe donc à la coloration différentielle de Dujardin (l'ancètre de la W3A en 3 ou 2 bains).

Là aussi, je veux bien chercher... mais "on" me reproche quand les gens découvrent le lien vers mon travail de pano sur des coupes, que ça ne correspond pas à ce que vont voir les élèves (fast-green et safranine -> colo inversées par rapport au carmino-vert des lycées...)
Après, si le travail photo est naze parce que la coloration n'est pas terrible, c'est encore un dilemme.
J'ai par ailleurs de quoi faire avec du bleu etzold de Klaus (j'ai un flacon... mais je bute aussi sur le protocole -> décoloration à l'alcool... combien de temps)

... et dire que les collègues passent commande chez Nublat ou Jeulin ou BégéNat...

[Maraussan]

Bonsoir,
primo, pour répondre à Olivier, je ne connais pas l'Aquatex. J'ignore sa formulation et ne connait pas son distributeur. Il existe et a existé une foule de médium auto-proclamés révolutionnaires, formules secrètes évidemment etc... Le PVA par exemple, en tant que base des milieux de montage, n'a plus la cote depuis des décennies.
En histologie professionnelle, les produits sont normalisés, formulation publique (même si celle-ci fait l'objet d'un brevet). Il s'agit de connaitre les risques pour les utilisateurs, et d'assurer une garantie décenale minimum des préparations.

Protocole d'inclusion au PEG :
Faire fondre du PEG 4000 pur dans une coupelle en pyrex (on obtient un liquide complètement transparent) : le point de fusion est à 54-58°C. Y laisser les pièces durant 6 heures afin de permettre une bonne imprégnation.
Faire fondre du PEG 20000 pur dans une autre coupelle en pyrex (le point de fusion est à 58-63° C.) et y placer les pièces durant 1 heure en les sortant directement de l’autre bain.
IL s'agit d'une inclusion progressive, en 2 bains, de PEG-4.000 puis PEG-20.000
Pas trace donc d'un monobain en PEG-4.000

Coloration : je comprends qu'il ne fasse pas changer les références colorimétriques.

Parallèllement, rien ne t'empèche de collorer pour toi qq coupes avec la coloration de Dujardin ou W3A (Dujardin amélioré, la Chrysoidine est remplacée par l'Acriflavine).

[Fredlab]

Hello

Coloration : je comprends qu'il ne fasse pas changer les références colorimétriques.
Parallèllement, rien ne t'empêche de colorer pour toi qq coupes avec la coloration de Dujardin ou W3A (Dujardin amélioré, la Chrysoidine est remplacée par l'Acriflavine).

Oui, je conçois aussi les choses comme ça - c'est aussi pour ça que je parle de coupes vidées et d'autres non (on a encore des références avec des coupes vidées)

Je veux bien tenter plein de choses, multiplier les protocoles, mais à l'heure d'une production, je ne suis pas sûr de vouloir perdre du temps.
Pour en revenir aux coupes zoomifiables, ça demande une demi-journée de "travail" pour arriver à un résultat (voire deux à quatre fois plus pour les coupes interprétées) ... pas sûr que je le fasse pour une coupe vidée au carmino-vert, une non vidée, une colorée à la Dujardin, une à l'Etzold...
Il va aussi falloir que je motorise les prises de vues (en X et Y)

Je prends note pour le PEG 20 000 - encore une commande à passer...
pour ce qui est des colorants supplémentaires (Dujardin), j'hésite...
(et il fort probable que je fasse dealer pour du PEG 1500 du coup... ou alors j'arrive à faire modifier ma commande chez Roth)

Merci Olivier pour ton retour d'expérience pour l'aquatex - c'est un nom que j'ai effectivement vu passer.

[Maraussan]

Le PEG 20.000 est dispo chez Carl Roth France, ou Sigma Aldrich France...
Cela doit etre bien dur, est-ce assez plastifiant et adhérant aux objets inclus ??
A voir, jamais pratiqué.

Coloration de Dujardin : ancètre de la coloration W3A et Etzold (c'est pareil, juste 3 bains au lieu de 2). Adopter l'Etzold bien sur, c'est bien plus beau...

[Fredlab]

Hello

Une question...

Pour stabiliser les colorations des coupes histologiques, les produits sont extrèmements difficiles à se procurer en petite quantité. Le plus simple est de se rabattre vers un anti-oxydant classique, ayant fait ses preuves en fluorochromie. Tel le E310 que l'on trouve facilement en France (Nipanox S1, 3,4,5-Trihydroxybenzoic acid propyl ester, CAS 121-79-9), à la dose maximale de 0.5% en solution (étant entendu que celui-ci n'est ni un buffer, ni un conservateur...).

Chez Roth, le Rotichrom est équivalent ?
(enfin, là aussi, il faut que l'usage ne soit pas trop complexe et il faut que ça soit plus qu'utile... pas sûr que l'on ait besoin que les coupes se conservent des dizaines d'années)

[Maraussan]

Bonsoir,
une préparation colorée se conserve plus de 10 ans, sous certaines réserves (**). Si ton but est de présenter à tes étudiants les protocoles de préparation, essentiellement sous le mode des concepts, il n'est pas nécessaire de fixer les colorations.

(**) les réserves...
- la seule prise en compte de l'indice de réfraction des milieux de montage non tamponnés est à l'origine d'une catastrophe historique quant à certaines collections montées dans des pH aussi bas que 4. Exemple : les milieux à base de gomme arabique/acacia, comme le triste sirop d'Apathy, et d'autres milieux de synthèse.
- l'utilisation d'eau de Javel, d'hyprochlorite dans certains protocoles ("vidage" des tissus botaniques) est un facteur d'oxydation des colorants. Même bien lavées, la perrénité des préparations est mise en cause dès le début du process. Un pourcentage non nul d'ions chlore reste prisonnier des structures.
- d'autres ...

Rotichrom : connais pas, j'ai pas trouvé la fiche, et la structure moléculaire ne correspond pas tout à fait. Et j'ai pas le temps ce soir de regarder plus !

[Christian]

Protocole d'inclusion au PEG :
Faire fondre du PEG 4000 pur dans une coupelle en pyrex (on obtient un liquide complètement transparent) : le point de fusion est à 54-58°C. Y laisser les pièces durant 6 heures afin de permettre une bonne imprégnation.
Faire fondre du PEG 20000 pur dans une autre coupelle en pyrex (le point de fusion est à 58-63° C.) et y placer les pièces durant 1 heure en les sortant directement de l’autre bain.

Ayant fait pas mal d'essais avec des lichens, je doute que quelques heures suffisent pour imprégner des objets du genre tiges ou pétioles... !

[Maraussan]

Tout à fait d'accord, le texte copié/collé n'était qu'un extrait de la synthèse publiée par Marcel Lecomte, destiné à faire toucher du doigt à Frédéric qu'après le bain de PEG-4.000, il y avait un deuxième bain, de PEG-20.000 cette fois-ci.

Notons qu'il s'agit d'imprégation de tissus mycologiques, particulièrement laches en structures, faciles à imprégner.
Le PEG semble mal, voir très mal diffuser dans des tissus d'avantage fermés. Mais restons positif et attendons les premiers essais. Il me semble nécessaire d'envisager un test de pénétration sur 24 heures, en plusieurs bains successifs, à l'image du protocole d'imprégnation classique à la paraffine.

L'utilisation de PEG en histologie animale fût (et reste à ce jour) un échec total.

(*) ESSAI de synthèse des techniques à employer pour arriver à des préparations définitives de pièces traitées pour une coupe au microtome automatique.

[Fredlab]

Hello

J'ai modifié la commande et j'ai fait acheter du PEG 20000
Pour l'imprégnation, je me dis qu'il n'est peut-être pas nécessaire de faire durer les choses... en fait, les cellules végétales sont encadrées par une paroi, elles sont moins "lâches" que des cellules animales.
Du coup, une inclusion est peut-être suffisante.

Il est clair qu'il va y avoir une phase de tests...
Je vous tiendrais au courant de mes observations.
(dans un autre fil)

Comme j'envisage de couper des structures complexes et complètes (bourgeons floraux...) - pas dans l'immédiat, hein... déjà réussir de belles coupes simples... - il faudra certainement adapter les protocoles, les milieux d'inclusion (s'il faut passer à la paraffine, j'achèterai ce qu'il faut)...
J'avais dit aussi qu'il y avait peut-être un moyen de faire pénétrer la "cire" au coeur des structures en bossant avec une pompe à vide... je délire peut-être, mais au lycée, on a ce genre de chose...