Coloration histo végétale: gros problème! (Carmino-Vert)

[Maraussan]

C'est la technique inverse de celle dite "de Mirande", 2 bains au lieu d'un seul !!!
La conservation est meilleure, les différenciations supérieures...
En 2008, le Vert d'iode (C.I. 42556) est fréquemment remplacé le Vert de méthyle (C.I. 42585), ou bien le Vert d'éthyle (C.I. 42040). Le Bleu de méthylène est aussi utilisé (à ne PAS confondre avec le Bleu de méthyl) ...

[Christian]

Bonjour Pierre, tous,

Bonsoir, je cherche de l'aide: en confectionnant des coupes végétales je rencontre systématiquement un problème: mes coupes se décolorent lorsque je les repasse dans la série des alcools avant le toluène. Ce constat est valable pour le carmin aluné, la safranine; le vert d'iode résiste. Que faire, où est l'erreur? Ose-t-on laisser la coupe colorée sécher et l'inclure directement (j'utilise l'eukitt)?
Merci pour vos propositions.

Tes colorants sont en solution alcoolique ou aqueuse ?? Ca change les méthodes de rinçage.
Et ne sont-ils pas trop vieux … ??

Pour la Safranin (in cellosolve pour ma part) elle se conserve assez bien (là elle a plus de 5 ans)
en revanche j'ai eu du Carmino-Vert de Mirande qui dès le départ n'était pas terrible (de chez Pierron) … idem pour mon Carmin aluné (trop vieux je pense), qui ne tiennent pas non plus les rinçages, malgré l'application de protocoles rigoureux !
Comme Klaus le disait, c'est pas une coloration qui est faite pour durer très longtemps et les produits prêts à l'emploi non plus !
J'avais aussi acheté du rouge de Ruthéniumn chez Marcel qui était nase dès réception ...

Pour Safranin + Bleu astra ou Safranin + Vert intense
Les bleus sont plus tenace que les rouges, on a vite fait de sur-colorer de ce côté: Pour ma part je force sur le rouge et minimise un peu le bleu. En général après les lavages, je trouve un bon équilibre, au pire hop un petit coup de décoloration dans l'HCL, mais il faudra re-rincer pour bien éliminer ce dernier et voir recommencer une des coloration.
(au passage ne jamais laisser sécher la préparation, c'est sûr)

Quelques infos (Pierre tu les connais mais je les place pour tous):

Un article de Guy Auderset, Dr. genevois en biologie.
Celui-ci traite particulièrement du Carmin et du vert d'iode en histologie végétale:
Coloration de la cellulose et de la lignine ou Mirande revisité
http://www.microscopies.com/DOSSIERS/Ma ... ations.htm

Le site de Marcel Lecomte et ses fiches techniques
http://users.skynet.be/Champignons_passion/main.htm

Et un sujet sur le forum ou nous discutions du Carmino-Vert
http://www.lenaturaliste.net/forum/view ... mino#p4330

[Klaus]

Merci Christian,

maintenant je me souviens d´avoir lu l´article de Guy Auderset. C´était avant mon premier essay de devenir membre de microscopia.
Dans ses descriptions de la méthode il a fait un petit faute:

• Deshydrater : 2 bains alcool absolu, remplacer par du trichloréthylène( remplace le xylol et le risque d'explosion, mais vapeurs toxiques…)
• Monter sur lame dans une goutte de résine, en appliquant rapidement la lamelle couvre- objet car la diffusion du trinitro

Il avait ecrit au lieu de trichloréthylène trinitrotoluène (un explosiv) je lui ai ecrit un mail et il m´a répondu qu´il va corriger cette faute. (il a fait, mais oublié de corriger tous: trinitro... )

Maintenant j´ai vu encore une fois les résultats de cette colo. Le rouge me semble un peu brune et le vert un peu pâle.

Que j´aime très bien c´est la précission de sa description, c´est vraiment perfecte!

Dit à côté: le trichloréthylène est absolument interdit chez nous à cause de la protection de l´environ.

Pour revenir au sujet de Pierre: je pense que ça sera bon d´éleminer la première rinsage avec l´alcool 70% et de commencer avec éthanole 96%.

[PierreBeaud]

Klaus et Maraussan, merci encore pour vos infos.
J'utilise un protocole transmis par l'institut botanique de l'uni de Lausanne ainsi que du carmin selon Grenacher.
Je ne respecte pas les étapes 17, 18, 19, vu que mes coupes sont déjà passablement décolorées après le premier bain d'alcool.
Je vais donc tenter la solution de Klaus.

Scan-081010-0001.jpg (131.73 Kio) Vu 7863 fois

[Christian]

Re,

Si on monte à la Glycérine Gélatinée, les passages à l'alcool ne sont pas nécessaires pour un Carmino-Vert.
Il sont même déconseillés à mon avis ...
Personnellement, les seuls essais que j'ai monté au Baume du Canada avec cette double coloration étaient très décevants !
En revanche, à la GG et en suivant le protocole ci-dessous (+ colorants aqueux) le résultat était satisfaisant:
(nb: de la simple glycérine est utilisée ici)

poireau_72dpi.pdf

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trinitro
Je pensais aussi que c'était corrigé

[Christian]

J'oubliais:

J'ai une dizaine de lames faites par les élèves de G.Auderset (Carmino-Vert + GG) je vais revoir où en est la coloration dans le temps...

[Klaus]

Re Christian,

merci pour cette excellente documentation!

Un bon truc de bouillir les feuilles de poireau pour enlever l´épidermis facilement!

Domage que le résultat n´est pas démonstré.

[Christian]

Re Klaus,

Un bon truc de bouillir les feuilles de poireau pour enlever l´épidermis facilement!

Oui et cela joue aussi le rôle de fixateur !

Domage que le résultat n´est pas démonstré.

On peut voir une coupe de M.Cornuet ici (3.1): http://g2e.ensg.inpl-nancy.fr/UserFiles ... 2_2007.pdf

[Maraussan]

Personnellement, les seuls essais que j'ai monté au Baume du Canada avec cette double coloration étaient très décevants !

J'ai des préparations botaniques (il était obligatoire de s'initier à la cytologie et histologie végétale, avant l'animale), au Vert d'iode - Carmin aluné, réactifs tous obligatoirement préparés par l'utilisateur, montés au Baume, datant des années 1967-1973 (faites par Mr le Professeur), et de 1973-1975 faites par moi.
Vu ce matin: pas bougé d'un poil, pas d'un, c'est même extraordinaire...

Le protocole était le suivant, si vous désirez comparer :
- nettoyer les tissus à l'hypochlorite de sodium 40%, 2 bains successifs
- puis quelques secondes dans une solution de soude à 5% (potasse caustique)
- double rinçage à l'eau distillée
- tamponer quelques minutes dans un bain d'eau acétifiée à 1%
- première coloration différentielle au Vert d'iode durant 2 à 3 minutes
- rincer rapidement à l'eau distillée
- deuxième coloration différentielle au Carmin de Grenacher durant 10 à 15 minutes
- rincer rapidement à l'eau distillée
- montage dans la gélatine glycérinée directement
Nous montions à l'Eukitt aussi, il fallait donc préalablement deshydrater et passer dans le Xyol.

NOTE: prendre grand soins d'éviter toute forme de contamination des réactifs principalement par l'hypochlorite, et éviter l'oxydation des réactifs (on bouche !!!)
* en italique, des étapes enseignées à l'époque comme obligatoires et fondamentales

Carmin aluné de Grenacher: carmin 1g, alun de potassium 5g, eau distillée 100ml, dissolution à chaud, filtrer, puis acide phénique 0,5g.
Vert d'iode à 1%: vert 1g, alcool à 60 degrés 20ml, eau distillée pour faire 100ml.

[Maraussan]

Pour PierreBeaud
2 à 20 secondes dans le Vert d'Iode, punaise, je la connaissais pas celle-là !!!
A peine trempé 2 seconde dans le Vert, on passe la coupe x fois dans l'alcool... je comprends qu'il ne reste plus rien.
UN c'est trop court (hypothèse), plus DEUX l'alcool est peut-etre inutile (re-hypothèse).

Facile à tester.