PEG et apothécies de Lichens

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PEG et apothécies de Lichens

Messagede 6le20 » 17 Mar 2017 09:43

Bonjour à tous

Je crée ce sujet pour mettre au point la méthode pratique et réserve ce premier message du fil pour y exposer la synthèse méthodologique confirmée par la pratique, que vous m'aiderez à mettre au point :mrgreen: .

En effet, je trouve qu’il y a des fils de conversation, parfois fort long, où toutes les données pratiques se retrouvent noyées dans un flot de mots rendant la vision méthodologique confuse…

SYNTHESE (du 10 05 2017)

Protocole suivi :
- Laisser sécher le lichens 24 à 48 h s'il est humide.
- Choix et préparation de 3 à 5 apothécies sous la bino.
- Chauffage de la lame couverte de PEG sur une lampe à alcool.
- Immersion dans le fondant du PEG en tournant et retournant les pièces à immerger, quitte à donner un petit coup de chauffe supplémentaire.
- Après refroidissement, coupe à la Gilette neuve sous la bino.
- Transfert dans un verre de montre de tous les copeaux par brossage.
- Triple nettoyage à l’eau du PEG (important).
- Choix des meilleures coupes et transfert sur une lame propre dans une goutte d’eau.
- Epongeage de l’eau avec un papier absorbant.
- Ajout du bleu coton lactique et de la lamelle.
- Pompage de l’éventuel surplus à l’aide d’un coin de papier absorbant.

Remarques importantes :
- Il ne faut pas hésiter à se munir d’une lame neuve pour réaliser les coupes.
- Il ne faut pas hésiter à rincer abondamment à l’eau le PEG, car sinon il peut subsister sous la forme de gouttes de toute taille, non miscibles, entre lame et lamelle, altérant la visibilité de la préparation.


Cette méthodologie concerne les apothécies de Lichens bien sèches. Elle peut avec bonheur être transposée à d'autres sujets d'observation comme des petites coupes végétales, par exemple les feuilles de mousses, ou des podétions de Lichens, ou autres qui ne me viennent pas spontanément à l'esprit. A mon sens des objets de 2 à 3 mm de hauteur maximale.
Au-delà, la méthodologie doit être plus complexe (voir ci-dessous).
Amicalement

Sylvain
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Re: PEG et apothécies de Lichens

Messagede 6le20 » 17 Mar 2017 09:51

Bonjour à tous

Suite à mon sujet Aloina, où j’ai découvert l’existence du PEG, j’ai fait l’acquisition de PEG 4000 auprès de Marcel Lecomte.
Puis j’ai lu le sujet de Ralph Wagner consacre à Caloplaca erythrocarpa où il parle de « moule » pour enrober les apothécies.
Puis j’ai lu le sujet Histologie Végétale et Inclusion en Paraffine ? (+PEG) ou l’on trouve ce message d’André et, plus loin, le lien qu’y consacre Marcel Lecomte sur son site.
Plus spécifiquement j’ai lu la méthode de Ralph appliquée au lichens (dont on trouvera la traduction d'André ci dessous).
Et j’ai lu tout un tas de messages consacrés aux coupes en général…

Du coup j’ai quelques questions.
- Les apothécies doivent-elles être humidifiées juste avant ? La veille ?
- Qu’en est-il de la méthode PEG + glycérine ?
- C’est quoi le « PEG 20% » de Ralph ?
- Doit-on mouler comme Ralph ce qui a l’avantage de pouvoir former un objet plus grand introductible dans un microtome de Ranvier ? Quel sont les dimensions de ce moule ? Sa matière ?
- Peut-on simplement utiliser la méthode d’André en chauffant le PEG sur un plastique rigide et faire la coupe à la main avec une gilette : le cas des bryophytes est-il transposable aux apothécies ? Peut-on remplacer le support plastique d’André par une lame de verre ?

Souvent, les apothécies méditerranéennes sont déshydratées et dures. Comment feriez-vous pour en faire de fines tranches ???

Lentement mais surement, j’ai réuni une bonne partie du matériel nécessaire. D’ici quelques jours il sera complet. Aussi j’aimerai bien comprendre la méthodologie à suivre pour mes premiers essais.

Méthode de Ralph:
a) Poser un petit bout de matériel sec (max. 20x10mm), sur une lame.
b) Imbiber goutte à goutte d'une solution à 20% de PEG 2000. 3-4 gouttes suffisent, voire moins pour de petites folioles de mousse
c) Laisser sécher. Ceci peut aussi se faire sans réchauffement, simplement par un temps de mise en attente (24 heures). Cependant on peut aussi poser la lame sur un radiateur ou dans le séchoir (pas à plus de 50°C).
L'eau s'évapore et reste alors le PEG imprégnant la trame de la plante qu'il stabilise et durcit.
d) Ensuite couper avec la lame de rasoir sous le stéréo-microscope directement sur la lame: surtout ne pas détacher le matériel de la lame avant de couper!
e) Ré-imbiber la tranche prête avec une goutte d'eau pour que le PEG en 2000 se dissolve à nouveau.
f) Eventuellement teinter la coupe, couvrir dans l' Euparal et ensuite la "microscoper"
Amicalement

Sylvain
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Re: PEG et apothécies de Lichens

Messagede André » 17 Mar 2017 10:03

Bonjour Sylvain
Pour les lichens j'utilise toujours du matériel réhydraté...d'ailleurs pour les déterminer avec leurs caractéres macroscopiques , il faudra bien passer par là !
Pour le PEG, j'utilise la technique de Ralph que tu cites plus haut, mais avec des grains de PEG que je fais fondre sur et dessous le sujet. Par contre, dès que les coupes sont faites, j'y ajoute une goutte d'eau et couvre d'une lamelle .
Sous forme liquide c'est peut être plus facile ?
Amicalement
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Re: PEG et apothécies de Lichens

Messagede Maraussan » 17 Mar 2017 10:10

Bonjour,
je laisse le soin aux spécialistes du PEG de répondre à tes questions.

Mon intervention se borne à préciser un point crucial de TOUTES les techniques d'inclusion (PEG, plexi, micro-cires ou parafine...).
Inclure est simple.
Mais au moment de la coupe, il y a une "réaction d'appui" du spécimen dans son milieu d'inclusion.
En ce sens que si il n'y a pas une adhérence parfaite entre le spécimen et le milieu d'inclusion, tout semble à priori bon mais ce n'est que la mise en œuvre d'un décor, inefficace. Se produit une délamination objet/milieu, même si celle-ci est invisible à l’œil. La coupe se plisse, se ratatine, se fracture. Des artefacts visuels apparaissent, due à la dissociation des tissus.

Il est donc important (le mot est faible...) de travailler l'adhérence du spécimen. Pour le PEG (phase aqueuse), préparer préalablement la surface du spécimen avec des tensio-actifs puissants. A défaut de mouillants spécifiques, on peut utiliser des nettoyants de marque pour sols. Les liquides à vaisselle ne sont pas efficaces.

Évident, pour les inclusions en micro-cires, ce sont de toutes autres techniques, mais fallait-il le préciser ?
Dernière édition par Maraussan le 17 Mar 2017 15:39, édité 1 fois.
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Re: PEG et apothécies de Lichens

Messagede 6le20 » 17 Mar 2017 14:37

Bonjour tous

Merci Alain pour ces précisions primordiales.

Justement Ralph semble utiliser des gouttes "à 20% de PEG" pour imbiber ses sujets en profondeur, ce qui doit les rendre solidaires de la gangue.

D'où ma question : c'est quoi ce PEG à 20 % ???

Peut-être Yvan donne la réponse ici :

Préparation du PEG selon Krauter
Ajoute 0,5ml de glycérine a 20 g de PEG 1500 et laise fondue dans un étuve. Le mélange est hygroscopique et doit être garder dans un flacon bien ferme.


Méthode
Les objets sont préférablement fixer dans un fixative aqueux et bien laver dans l'eau. Ils sont placer dans un verre rempli d'un dilution à 20% du PEG selon Krauter. On prépare ce dilution dans un étuve en ajoutant 4 parts d'eau sur 1 part du mélange PEG-glycerine. On marque l'hauteur du liquide le verre et on divise cette hauteur en 5 parts égaux. On place le tout dans un étuve à 60°C pendant 3-4 jours. Durant ce temps l'eau s'évapore. Les objets flotter initialement, mais au fur et à mesure qu'ils sont imprègne avec le mélange de PEG-glycerine, ils baisser dans le liquide. Quand le verre ne contient qu'un cinquième du volume original, on faits les blocs. On remplit les formes faites avec un peu du papier d'aluminium avec le PEG selon Krauter non dilue, on ajoute l'objet et. Puis le tout est mis dan un endroit fraîche, préférablement dans un réfrigérateur enfin de se solidifier. Vue la nature hygroscopique du PEG, on garde les blocs dans un bocal bien ferme.



Quelqu'un connait-il d'expérience ?
Amicalement

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Re: PEG et apothécies de Lichens

Messagede Maraussan » 17 Mar 2017 15:42

Si c'est la question (?), un PEG à 20% est constitué de 20% de PEG et 80% d'eau. Le tout faisant bien 100%.
Mais % de quoi ? Plus loin, on comprends que les mesures sont exprimées en volume (et non en poids), et donc 1 volume de PEG sec en poudre pour 4 volumes d'eau. La précision est approximative, mais doit suffire.
Mais une fois dilué, on ne se retrouve pas avec 5 volumes de préparation. Prudence...

L'erreur commune est de penser qu'il faut 20 de matière pour 100 d'eau.
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Re: PEG et apothécies de Lichens

Messagede 6le20 » 21 Mar 2017 12:28

Bonjour tous

Bon je me suis lancé dans une première expérimentation et je dois dire que je suis enchanté par la simplicité de la méthode et ses résultats ! :D

Bien sûr, je ne suis pas parti directement sur des apothécies de lichens :mrgreen: , mais sur des écidies de Puccinia smyrnii rencontrés le jour de l'équinoxe... Cette rouille m'avait déjà servi à illustrer des généralités pour une bonne compréhension du cycle de ces champignons parasites..., il faudra que je me décide à la mettre en collection.... :mrgreen:

Pour en revenir au PEG
- J'ai découpé un morceau de feuille parasitée comportant deux écidies proches.
- Sur une lame de microscopie, j'ai déposé de la pointe d'un sclpel un peu de PEG 400
- J'ai fait fondre sur une lampe à alcool
- Avec des pinces brucelles j'ai tourné et retourné le morceau de feuille dans le fondant
- j'ai ajouté par dessus un peu de PEG
- j'ai chauffé à nouveau
- Quand tout a été fondu, j'ai posé la lame sur une surface lisse et froide

J'ai alors surveillé à la bino de la pointe des brucelles que le produit figeait. Quand je l'ai jugé solide, j'ai pris une lame gilette et j'ai découpé une vingtaine de tranches sous la bino.
Comme toujours en bon débutant, j'ai mis trop de produit... :mrgreen:
Puccinia smyrnii-PEG-Luc-02 2016-LG.jpg
Exif et Meta MicroCartouche Puccinia smyrnii-PEG-Luc-02 2016-LG.jpg (47.93 Kio) Vu 7990 fois


- Avec les brucelles j'ai déplacé toutes les coupes sur une lame propre.
- J'ai ajouté quelques gouttes d'eau sous la bino et j'ai écarté les coupes les plus épaisses, n'en conservant que 4.
- J'ai épongé le surplus d'eau deux fois
- Puis j'ai monté une lamelle à l'eau et pris mes photos.

Les écidies présentées mesurent entre 650 et 700 µm.
Puccinia smyrnii-3aCoup-Luc-02 2016-LG.jpg
Exif et Meta MicroCartouche Puccinia smyrnii-3aCoup-Luc-02 2016-LG.jpg (53 Kio) Vu 7988 fois



Sur la coupe suivante, on voit bien que les tissus de la plante se sont déchirés avant que le péridium composé de cellules allongées ne s’ouvre. Naturellement les écidiospores s’accumulent à la sortie… (gros plan photo suivante).
Puccinia smyrnii-3bCoup-Luc-02 2016-LG.jpg
Exif et Meta MicroCartouche Puccinia smyrnii-3bCoup-Luc-02 2016-LG.jpg (45.68 Kio) Vu 7987 fois

Puccinia smyrnii-3cCoup-Luc-02 2016-LG.jpg
Exif et Meta MicroCartouche Puccinia smyrnii-3cCoup-Luc-02 2016-LG.jpg (72.16 Kio) Vu 7987 fois



Maintenant que j'ai pris contact avec ce matériau, il me parait plus aisé d'envisager la suite, même si la difficulté particulière des apothécies de lichens me semble leur dureté par rapport à une feuille de Smyrnium. Ce premier contact m'était nécessaire...
Amicalement

Sylvain
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Re: PEG et apothécies de Lichens

Messagede 6le20 » 27 Mar 2017 06:52

Bonjour à tous

Seconde expérience : 26 mars 2017
Un résultat négatif étant tout de même un résultat…, je prends note de celui-ci !

Anticipant sur la dureté des apothécies, j’ai mis celles-ci à tremper pendant 72h dans de l’eau distillée puis :
- Je les ai épongées sur un buvard
- J’ai fait fondre du PEG sur une lame à l’aide d’une lampe à alcool.
- De la pointe des brucelles j’ai tourné et retourné les apothécie dans le fondant.
- J’ai recouvert de PEG et attendu que le froid fige l’ensemble.

Le PEG ayant pris :
- J’ai découpé en tranches sous la bino
- Là j’ai vu une apothécie entière sortir, entrainée par le rasoir
- J’ai quand même tout découpé en aveugle, car rapidement les petits morceaux de PEG masque tout sauf du coté de la coupe
- J’ai transféré l’ensemble des copeaux dans un verre de montre
- Ajouté de l’eau distillé
- Et vu toutes mes apothécies intactes…

Donc trop d’humidification les désolidarise du PEG… et rend les coupes impossibles.
Amicalement

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Re: PEG et apothécies de Lichens

Messagede 6le20 » 27 Mar 2017 06:52

[suite]

Troisième expérience : 26 mars 2017.
Du coup je prends le parti-pris inverse, je saute sur le premier chêne vert venu à 5 mètres du camion, examine un lichen verdâtre qui est abondant sur le tronc (c’est apparemment la seule espèce) et je découpe au suisse une zone couverte d’apothécies lécanorines de 1,5 à 2 mm.
- J’en extrais trois sous la bino
- Je les immerge dans le fondant du PRG
- Laisse refroidir
- Découpe à la gilette
- Rince les coupes à l’eau deux fois en épongeant
- Sélectionne les plus minces sous la bino
- Monte une lame en ajoutant une goutte de bleu coton lactique et observe…

Au début, c’est pas la joie. Pas trace d’hyménium. Puis à la dernière coupe examinée…, YESSS !

Coupe de l’apothécie (pano 3 photos avec ICE) :
LICH 36-5aApoth-Cesseras-26 03 2017-LG.jpg
Exif et Meta MicroCartouche LICH 36-5aApoth-Cesseras-26 03 2017-LG.jpg (67.21 Kio) Vu 7921 fois


Asques et paraphyses :
LICH 36-6aAsqPara-Cesseras-26 03 2017-LG.jpg
Exif et Meta MicroCartouche LICH 36-6aAsqPara-Cesseras-26 03 2017-LG.jpg (52.89 Kio) Vu 7924 fois


Et même une spore libre qui montre sa cloison et ses guttules :
LICH 36-6bSpor-Cesseras-26 03 2017-LG.jpg
Exif et Meta MicroCartouche LICH 36-6bSpor-Cesseras-26 03 2017-LG.jpg (44.65 Kio) Vu 7921 fois



J’ai donc réuni tous les éléments microscopiques pour une étude lichénique, de justesse…

Revenons au PEG.
Victoire mais :
- Il a plu très fort hier
- Epaisse rosée ce matin
- Vent marin chargé d’humidité toute la journée.

Pour reproduire ces conditions météorologiques particulières et comprendre leur éventuel impact, il va me falloir expérimenter avec une même espèce :
- à sec (temps que je n’ose plus dire habituel ici, tant il a plu ces 6 derniers mois)
- et en chambre humide pour me rapprocher de l’état hygrométrique d’aujourd’hui.

Par ailleurs, 3 apothécies dans le PEG, c’est vraiment limite (une seule coupe d’hyménium, une seule spore libre…), il vaudrait mieux en mettre au moins 5, du moins le temps d’acquérir le coup de main…
Bon maintenant je vais tacher de déterminer cette espèce : Parmelina, Physcia ???
Amicalement

Sylvain
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Re: PEG et apothécies de Lichens

Messagede Maraussan » 27 Mar 2017 14:12

...Sur la coupe suivante, on voit bien que les tissus de la plante se sont déchirés...

...J’ai découpé en tranches sous la bino... Là j’ai vu une apothécie entière sortir, entrainée par le rasoir...

Bonjour à tous,
désolé de m’immiscer dans tes préparations, mais une phase d'étuvage de 10 heures minimum dans le PEG 4000 à température > 55° est considérée comme indispensable, sinon le spécimen n'est pas imprégné, et se dissocie du milieu d'inclusion lors de la coupe. Le spécimen étant obligatoirement fixé au préalable. A l'AFA - Alcool-Formol-Acétique par exemple.
L'imprégnation est un phénomène physique lent, hélas...

En vadrouille, je n'ai jamais trouvé mieux comme étuve/bain-Marie thermostaté qu'un simple chauffe-biberon. Ou un chauffe-cire à épiler, recyclé.
Dernière édition par Maraussan le 29 Mar 2017 08:29, édité 1 fois.
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