PEG et apothécies de Lichens

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Re: PEG et apothécies de Lichens

Messagede 6le20 » 28 Mar 2017 07:23

Maraussan a écrit:Bonjour à tous,
désolé de m’immiscer dans tes préparations, mais une phase d'étuvage de 10 heures minimum dans le PEG 4000 à température > 55° est considérée comme indispensable, sinon le spécimen n'est pas imprégné, et se dissocie du milieu d'inclusion lors de la coupe. Le spécimen étant obligatoirement fixé au préalable. A l'AFA - Alcool-Formol-Acétique par exemple.
L'imprégnation est un phénomène physique lent, hélas...

En vadrouille, je n'ai jamais trouvé mieux comme étuve/bain-Marie thermostaté qu'un simple chauffe-biberon. Ou un chauffe-cire à épiler, recyclé.

Merci Alain de ce conseil pertinent.
Comme tu vois, j'ai tendance à partir du plus simple vers le plus compliqué..., et puis je me dis que si André fait une utilisation basique du PEG, c'est qu'il a de bonnes raisons... :mrgreen:


Expérience 4 : 27 mars 2017
Une fois bien desséchées derrière le pare-brise, j’ai repris les apothécies de ma seconde expérience.
- J’en extrais 5 sous la bino
- Je les immerge dans le fondant du PEG
- Laisse refroidir
- Découpe à la gilette (beaux copeaux qui s’enroulent !)
- Rince les coupes à l’eau deux fois en épongeant
- Sélectionne les plus minces sous la bino
- Monte une lame en ajoutant une goutte de bleu coton lactique et observe…

Ce coup ci, j’ai près d’une dizaine de coupes exploitables, dont deux de doubles apothécies !
LICH 35-5aApot-Moux-21 03 2017-LG.jpg
Exif et Meta MicroCartouche LICH 35-5aApot-Moux-21 03 2017-LG.jpg (460.35 Kio) Vu 3016 fois


Néanmoins, avoir de belles coupes n’est pas une garantie d’obtenir des asques et des spores comme le montre la photo suivante qui résume l’examen de toutes les coupes :
LICH 35-6a-Moux-21 03 2017-LG.jpg
Exif et Meta MicroCartouche LICH 35-6a-Moux-21 03 2017-LG.jpg (49.01 Kio) Vu 3016 fois


Il ne faut pas en tirer de conclusions, car le traitement que j’ai fait subir à ces apothécies peut expliquer leur infertilité apparente : 72 h dans l’eau, puis 2 jours derrière le pare-brise en plein soleil… pas l’idéal pour des organismes dont la dessiccation est utilisée pour projeter les spores au loin…

Ce qui est important ici, c'est que l'inclusion directe d'apothécies dures, sans humectation, permet de réaliser à main levée des coupes fines tout à fait utilisables, sans aucun décollement de l'objet inclus (désolé Alain...).
J'ai même été surpris de voir de fins copeaux mixte PEG/apothécie s'enrouler lors de la coupe.


Quoiqu’il en soit, le PEG devient de plus en plus simple d’utilisation. Ce jour je vais l’essayer sur une coupe de feuille longue de Romulea et sur des podétions tubulaires de Cladonia rangiformis.
Amicalement

Sylvain
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Re: PEG et apothécies de Lichens

Messagede 6le20 » 29 Mar 2017 07:24

Bonjour tous

Expérience 5 : 28 mars 2017
J’ai donc immergé dans le fondant, parallèlement, un segment de podétion de Cladonia rangiformis (lichen) et un segment de feuille de Romulea ramiflora (plante à fleur), qui font à peut près 1 mm de diamètre.
J’ai fait des coupes dans le PEG et, en parallèle, des coupes à la main, pour comparer les méthodes.

Les podétions de Cladonia rangiformis
Ceux-ci se présentent sous forme de fins tubes creux et je craignais que le PEG ne puisse assurer la cohésion tubulaire. En fait, les coupes furent toutes réussies, seules les plus minces étant fracturées. Par contre à la main, ce fut une catastrophe et rien ne fut exploitable.
Coté microscopie, je n’ai pas été au top. Déjà que ma caméra d’oculaire usb est incapable de restituer ce que je vois avec clarté aux faibles grossissements (x4 et x10)… J’ai tout d’abord immergé mes coupes dans de l’eau glycérinée, qui a l’avantage de montrer les fractures dans les tissus dues à la coupe :
Cladonia rangiformis-7aCoupPod-Cesseras-27 03 2017-LG.jpg
Exif et Meta MicroCartouche Cladonia rangiformis-7aCoupPod-Cesseras-27 03 2017-LG.jpg (42.14 Kio) Vu 2967 fois


Le coté sépia c’est bien, mais la couleur révèle plus… J’ai donc ajouté une goutte de rouge congo sds sur le coté de la lamelle et j’ai pu voir en couleur, les différentes couches (x40, pano 2 images) :
Cladonia rangiformis-7bCoupPod-Cesseras-27 03 2017-LG.jpg
Exif et Meta MicroCartouche Cladonia rangiformis-7bCoupPod-Cesseras-27 03 2017-LG.jpg (68.32 Kio) Vu 2971 fois



La feuille de Romulea ramiflora
Avec le PEG, j’ai récupéré plus d’une dizaine de coupes parfaitement minces et absolument exploitables, tandis qu’à la main, la feuille s’écrasait sous la lame et je n’ai pas réussi une seule coupe de moins d’un demi millimètre.

J’ai appliqué la méthode de coloration suivie par Bernard, sauf que j’ai remplacé le vert par du bleu, au moment de ma commande, Klaus n’étant pas content de son dernier vert… :D
Et puis, j’ai transféré mes coupes sur une lame propre et j’ai merdé complètement. Les plus minces se sont repliées sur elles-mêmes ou sont restées entassées les unes sur les autres, tandis que je les immergeais dans un gel de glycérine translucide… générateur de bulles. Je ne m’en suis aperçu que dans les oculaires…
La photo suivante est donc la seule coupe exploitable partiellement, alors qu’elle faisait partie des coupes ratées, car la plus épaisse… un pano de 6 images (x10) assemblées par ICE qui ne rend absolument pas justice à ce qui était dans les oculaires.
Romulea ramiflora-7aCoupFeuil-Cesseras-27 03 2017-LG.jpg
Exif et Meta MicroCartouche Romulea ramiflora-7aCoupFeuil-Cesseras-27 03 2017-LG.jpg (49.42 Kio) Vu 2969 fois


Comme j’ai parfaitement pu le voir à la bino, la coupe de la feuille présente 5 lacunes. Je vais essayer, ultérieurement, de récupérer ces coupes en nettoyant le gel.

Indépendamment de mes ratés dus à mon manque de sommeil, le PEG se révèle un milieu performant pour la réalisation de coupes à main levée, aussi bien de tiges creuses, que de tiges pleines, particulièrement en ce qui concerne les Lichens.
Amicalement

Sylvain
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Re: PEG et apothécies de Lichens

Messagede 6le20 » 01 Avr 2017 16:33

Bonjour à tous

Expérience 6 : 1er avril 2017
Pour cette expérience, j’ai choisi les plus petites apothécies de Diplochistes muscorum (Scop.) R. Sant., dont je voulais confirmer la détermination par l’examen des spores.
Ici le disque des apothécies atteint difficilement le millimètre pour les plus grandes. Pour augmenter la difficulté, j’ai délibérément écarté celles-ci, faisant mon choix parmi celles qui avoisinaient plutôt le demi-millimètre.

Protocole suivi :

- Choix et préparation de 5 apothécies sous la bino.
- Chauffage de la lame couverte de PEG sur une lampe à alcool.
- Immersion dans le fondant du PEG en tournant et retournant les pièces à immerger, quitte à donner un petit coup de chauffe supplémentaire.
- Après refroidissement, coupe à la Gilette neuve sous la bino.
- Transfert dans un verre de montre de tous les copeaux par brossage.
- Triple nettoyage à l’eau du PEG (important).
- Choix des meilleures coupes et transfert sur une lame propre dans une goutte d’eau.
- Epongeage de l’eau avec un papier absorbant.
- Ajout du bleu coton lactique et de la lamelle.
- Pompage de l’éventuel surplus à l’aide d’un coin de papier absorbant.

Le résultat en image :
Diplochistes muscorum-4bApot-Cesseras-28 03 2017-LG.jpg
Exif et Meta MicroCartouche Diplochistes muscorum-4bApot-Cesseras-28 03 2017-LG.jpg (57.42 Kio) Vu 2918 fois


[Image obtenue par zédification de 10 images empilées par le logiciel de focus stacking Helicon Focus 6.6]
Diplochistes muscorum-6bAsq-Cesseras-28 03 2017-LG.jpg
Exif et Meta MicroCartouche Diplochistes muscorum-6bAsq-Cesseras-28 03 2017-LG.jpg (47.73 Kio) Vu 2918 fois


Diplochistes muscorum-6aSp-Cesseras-28 03 2017-LG.jpg
Exif et Meta MicroCartouche Diplochistes muscorum-6aSp-Cesseras-28 03 2017-LG.jpg (48.42 Kio) Vu 2917 fois



Remarques importantes :
- Il ne faut pas hésiter à se munir d’une lame neuve pour réaliser les coupes.
- Il ne faut pas hésiter à rincer abondamment à l’eau le PEG, car sinon il subsiste sous la forme de gouttes de toute taille, non miscibles, entre lame et lamelle, altérant la visibilité de la préparation.


Je ne sais pas ce que vous en pensez, mais pour ma part, je suis désormais convaincu qu’un protocole simple, comme celui décrit dans cette ultime expérience, donne des résultats fiables sans qu’il soit besoin d’expérimenter plus avant.
Amicalement

Sylvain
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Re: PEG et apothécies de Lichens

Messagede 6le20 » 10 Mai 2017 14:54

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